Bacteriën nader bekeken: de Gram-kleuring

Bacteriën zijn organismen die zo klein zijn dat ze met het blote oog niet kunnen worden waargenomen. Om ze te kunnen bestuderen wordt onder andere gebruik gemaakt van de microscoop. Het is nodig om bacteriën te kleuren voordat ze bekeken kunnen worden onder de microscoop. Een van de methoden die hiervoor worden gebruikt is de Gram-kleuring, ofwel de kleuring volgens Gram. Over het principe en de methode van de Gram-kleuring.

Inleiding

Bacteriën zijn te klein om met het blote oog te kunnen waarnemen. Om ze te kunnen bestuderen is daarom een microscoop nodig. De meest gebruikte is de lichtmicroscoop, waarmee een vergroting van duizend keer kan worden verkregen. Aangezien bacteriën doorzichtig zijn bij wit licht, moeten ze eerst gekleurd worden. Het contrast wordt door de kleuring vergroot en bovendien kunnen verschillende bacteriën verschillend worden gekleurd, waardoor herkenning eenvoudiger is. Een van de kleuringen die toegepast worden is de Gram-kleuring: genoemd naar de Deense microbioloog Hans Christian Gram (1853-1928), die deze techniek in 1884 ontwikkelde.

Werkwijze

Het maken van een preparaat
Voor het maken van preparaten worden objectglaasjes gebruikt.
Een objectglaasje is een rechthoekig stuk glas van ongeveer 2,5 bij 7,5 cm groot en ongeveer één mm dik, speciaal voor gebruik onder de microscoop. Hierop wordt wat bacteriemateriaal gesmeerd, eventueel met wat fysiologisch zoutoplossing. Vervolgens wordt het gedroogd aan de lucht.

Fixeren
Vervolgens moet er eerst fixatie plaatsvinden: dit is een techniek waarbij de bacteriën gedood worden. Ook worden de bacteriën hierdoor gehecht aan het objectglas, dat nu preparaat wordt genoemd.
Dit fixeren kan worden gedaan door:

• op het preparaat een oplossing van 96% methanol aan te brengen en vijf minuten laten inwerken
• het preparaat met behulp van een pincet een paar keer door een vlam te halen (flamberen)

De Gram-kleuring
Bij de Gram-kleuring worden de volgende reagentia gebruikt:

• kristalvioletoplossing: kristalviolet (methylviolet 10B) in water
• lugoloplossing: jodium en kaliumjodide in water
• ethanol 96%
• waterige fuchsineoplossing: fuchsine (pararosaniline) in water

Deze reagentia worden volgens een recept bereid, waarbij ook hulpstoffen worden gebruikt.
Ook de zuurgraad (pH) moet goed zijn voor het beste resultaat.
Het gefixeerde preparaat wordt nu gekleurd door het te behandelen als volgt:

• 1 minuut kleuren in een kristalvioletoplossing
• afspoelen met water
• 1 minuut behandelen met een lugoloplossing
• afspoelen met ethanol
• 1 minuut ontkleuren met ethanol
• afspoelen met water
• 1 minuut nakleuren met fuchsineoplossing
• afspoelen met water en drogen

Het principe van de Gram-kleuring

Door het preparaat eerst te kleuren met kristalvioletoplossing en vervolgens met lugol, ontstaat een verbinding tussen deze twee kleurstoffen: het kristalviolet-lugol-complex. Uit sommige bacteriën is deze verbinding niet door ethanol op te lossen; ze blijven blauwpaars van kleur en worden Gram-positief genoemd. De overige bacteriën verliezen door de behandeling met ethanol de blauwpaarse kleurstof en worden door de fuchsineoplossing roze-rood gekleurd. Deze heten Gram-negatief. Dit onderscheid kan bestaan door de verschillen in samenstelling van de celwand van de twee groepen bacteriën.

Onder de microscoop

De gekleurde, gedroogde preparaten kunnen nu onder de microscoop bekeken worden, bij een vergroting van duizend keer.
Hiervoor wordt op het preparaat een druppel olie (immersie-olie) aangebracht om een nog betere vergroting te krijgen.
Nu is duidelijk het verschil te zien tussen de blauwpaarse, Gram-positieve en de rode, Gram-negatieve bacteriën.