Kolomchromatografie versus dunnelaagchromatografie

Chromatografie is een scheidingstechniek gebaseerd op een opdeling van stoffen over twee niet-mengbare fasen. Deze twee fasen worden de stationaire fase en de mobiele fase genoemd. De mobiele fase (gasvormig of vloeibaar) stroomt continu langs de stationaire fase (vast of vloeibaar). Er zijn twee types van chromatografie: kolomchromatografie en dunnelaagchromatografie.

• Principe kolomchromatografie
• Principe dunnelaagchromatografie
• Scheiding van methylrood en methyleenblauw
• Via kolomchromatografie
• Via dunnelaagchromatografie
• Kwalitatief en kwantitatief onderzoek
• Kwalitatief onderzoek (Wat?)
• Kwantitatief onderzoek (Hoeveel?)

Principe kolomchromatografie

Bij kolomchromatografie wordt de stationaire fase in een buis gebracht en laat men de mobiele fase door de buis vloeien onder druk of gewoon onder invloed van de zwaartekracht. Voor het te scheiden mengsel op de kolom wordt gebracht, wordt eerst de mobiele fase door de kolom gestuurd. Hiervoor wordt een oplosmiddel of een mengsel van oplosmiddelen gebruikt en dit wordt ook wel de loopvloeistof of het eluens genoemd. Vervolgens wordt het te scheiden mengsel op de kolom aangebracht en wordt er daarna continu eluens op de kolom gebracht. Het mengsel zal zich onder invloed van het eluens doorheen de kolom verplaatsen. Bij gaschromatografie zal het mengsel eerst worden verdampt en zal het met een inert dragersgas door de kolom worden gevoerd. Doordat sommige componenten van het mengsel beter geadsorbeerd worden aan de stationaire fase in vergelijking met andere componenten zullen de verschillende componenten met een verschillende snelheid doorheen de kolom bewegen en alzo van elkaar worden gescheiden. De component welke het beste wordt geadsorbeerd door de stationaire fase zal als laatste de kolom verlaten. De retentietijd van een bepaalde component is de tijd die verstreken is tussen het aanbrengen van het mengsel op de kolom en het moment dat de component de kolom terug verlaat.

Principe dunnelaagchromatografie

Voor dunnelaagchromatografie wordt ook vaak de term TLC (thin layer chromatography) gebruikt. Bij dunnelaagchromatografie wordt de stationaire fase aangebracht op een drager. Deze drager kan een glasplaat, een aluminiumplaat of een plaatje kunststof zijn. Het kan ook gewoon een strookje filtreerpapier zijn. Op dit plaatje (of papiertje) wordt het te scheiden mengsel aangebracht met behulp van een capillair buisje. Met potlood wordt aangeduid waar het staal werd aangebracht. Dit plaatje wordt vervolgens in een ontwikkelingstank gebracht. Een ontwikkelingstank is een doorzichtig recipiënt met deksel waarin een laagje mobiele fase is gebracht. Voor de meting laat men het recipiënt een tijdje met eluens en met deksel accommoderen, dit om een goed vloeistof-gas evenwicht te verkrijgen. Het is belangrijk dat het laagje eluens lager is dan het mengselvlekje. Indien dit niet zo is, zal het mengsel gewoon in de mobiele fase oplossen en zal er dus ook geen scheiding optreden. Na het sluiten van de tank zal de mobiele fase door capillariteit doorheen het plaatje tegen de zwaartekracht in bewegen. Tijdens deze beweging zal dit het te scheiden mengsel ook meevoeren. Daar de ene component een sterkere affiniteit heeft voor de stationaire fase in vergelijking met een andere component zullen de componenten gescheiden worden. De component met de hoogste affiniteit zal het traagst naar boven bewegen.
Elke stof is gekenmerkt door een bepaalde R_f-waarde in een bepaald oplosmiddel.

R_f = a/b
Met

• a = afstand tussen plaats van mengselvlek tot plaats van individuele component na ontwikkeling.
• b = afstand tussen plaats van mengselvlek tot plaats van loopfront (mobiele fase) na ontwikkeling.

Scheiding van methylrood en methyleenblauw

Stel een dunne silicalaag en een kolom gevuld met silicapoeder en een mengsel bestaande uit methyleenblauw en methylrood opgelost in water/ethanol (50/50). Een deel van het mengsel zal worden gescheiden met behulp van dunnelaagchromatografie en een ander deel met kolomchromatografie. Als mobiele fase wordt voor beide technieken water/ethanol (50/50) gebruikt. Silica is een erg polaire stof. Polaire stoffen zullen dus een grote affiniteit voor de stationaire fase vertonen en dus minder gemakkelijk worden meegenomen door de mobiele fase.

Via kolomchromatografie

Het paarse mengsel zal zich scheiden in een rode en een blauwe band. Methyleenrood zal minder sterk worden geadsorbeerd door de silica in vergelijking met methyleenblauw. De twee kleurstoffen zullen dus met een verschillende snelheid doorheen de kolom bewegen. Wanneer de componenten de kolom verlaten, zullen ze 'gezien' worden door een detector. Deze meet hierbij een verandering in een fysische eigenschap zoals bijvoorbeeld de geleidbaarheid of de brekingsindex. Er wordt een grafiek geplot waarbij verschillende pieken i.f.v. de tijd zichtbaar worden. Dit wordt een chromatogram genoemd. Elke piek is afkomstig van een bepaalde component van het gescheiden mengsel. Daar methylrood eerst de kolom zal verlaten, zal de piek afkomstig van methylrood dus eerst in de grafiek verschijnen. t₃ is hier de retentietijd van methylrood en t₄ is de retentietijd van methyleenblauw met t₃ < t₄.

Via dunnelaagchromatografie

De paarse stip zal zich scheiden in een rode en een blauwe opstijgende vlek. Methyleenrood zal minder sterk worden geadsorbeerd aan de silica in vergelijking met methyleenblauw. De twee kleurstoffen zullen dus met een verschillende snelheid onder invloed van capillariteit naar boven bewegen. De loopvloeistof wordt het minst weerhouden door de silicagel en zal dus het snelst over het plaatje bewegen. De hoogte van de mobiele fase wordt het loopfront genoemd. Wanneer het loopfront tot op ongeveer 1 cm van de bovenkant van het plaatje is gekomen, wordt het plaatje uit de tank gehaald en wordt het chromatograferen dus gestopt. Het loopfront wordt aangeduid met een potloodlijn. Vervolgens kunnen de Rf-waarden van beide kleurstoffen worden berekend.

R_{f rood} = a_rood/b en R_{f blauw} = a_blauw/b

Omdat methylrood minder sterk wordt tegengehouden door de stationaire fase, heeft het dus een grotere R_f-waarde.

Kwalitatief en kwantitatief onderzoek

Kwalitatief onderzoek (Wat?)

De retentietijd en de R_f-waarde zijn specifiek voor elke stof bij een bepaalde loopvloeistof. Op basis van de verkregen waarden kan je dus ook weten welke stoffen er zich in een mengsel bevinden.

Kwantitatief onderzoek (Hoeveel?)

Dunnelaagchromatografie is minder geschikt om echt kwantitatief onderzoek te doen. De verkregen stoffen kunnen eventueel van het plaatje worden geschraapt. Het gehalte zou dan met een andere analytische techniek (bijvoorbeeld spectrofotometrie) kunnen worden bepaald. Soms wordt dunnelaagchromatografie wel gebruikt om semi-kwantitatief onderzoek te doen. Er worden naast de mengselstip dan ook ijkoplossingen met gekende concentraties gespot. Op basis van de intensiteit van de verkregen stippen kan dan de concentratie van een bepaalde stof worden geschat.

Bij kolomchromatografie kan het verkregen chromatogram gebruikt worden voor kwantitatief onderzoek. De oppervlakte onder elke piek is bepalend voor de hoeveelheid van die bepaalde component. Om uit de oppervlakte onder de piek de concentratie van de component in het mengsel te kennen, is uiteraard een ijking nodig. IJking gebeurt door een staal van de te bepalen component met een exact gekende concentratie op de kolom te brengen. Dit moet uiteraard onder exact dezelfde omstandigheden gebeuren als de scheiding van het mengsel. De oppervlakte onder de piek van de ijkoplossing wordt dan gelinkt met de gekende concentratie. Deze oppervlakte kan dan bij de echte meting als referentie dienen om de concentratie van de component in het mengsel te bepalen. Een voorwaarde voor dit kwantitatief onderzoek is wel dat de pieken van de verschillende componenten voldoende van elkaar zijn gescheiden. De componenten moeten dus op een voldoende verschillend tijdstip uit de kolom komen.