Genen in beeld

Een gen is een klein stukje DNA dat codeert voor één eigenschap. Genen zijn verantwoordelijk voor je genotype en je fenotype. We gaan er altijd vanuit dat genetisch alles wel goed zal zitten, maar toch komen mutaties vrij frequent voor. De genen coderen dan niet meer (goed) voor een bepaalde eigenschap of voor een bepaald eiwit, met alle gevolgen van dien. In zo'n situatie kan gentherapie uitkomst bieden. Rest nog één vraag: hoe ontrafelt men de genenvolgorde (die nodig is om toe te passen)? Dit artikel geeft inzicht in een aantal wetenschappelijke methoden betrokken bij het onderzoek van het genoom.

PCR-methode

Voor de wetenschap, en daaraan verwante zaken zoals de medische wereld, is het erg belangrijk de volgorde van het DNA te kunnen bepalen. Een methode waarmee dit mogelijk is, noemen we DNA-sequentie. Om deze methode toe te passen, is een drietal voorbereidingen nodig:

1. Een DNA-molecuul wordt in stukjes verdeeld (door het DNA door een zeer kleine opening te persen).
2. Van de afzonderlijke stukjes DNA wordt een (groot) aantal kopieën gemaakt.
3. Beide strengen van de stukjes DNA-molecuul worden door verhitting gescheiden.

Punt 2 betreft een groot aantal kopieën maken van de afzonderlijke stukjes DNA. Dat kan op grofweg twee manieren. Het DNA kan worden ingebracht in een bacterie.Wanneer deze bacterie deelt, krijgen alle nakomenlingen het ingebrachte DNA ook dus zo krijg je snel en veel identieke stukken DNA. Een tweede manier is de PCR-methode. Hierbij wordt er een stukjes dubbelstrengs DNA in een speciaal vat gedaan, waarmee men van alles gaat uitvoeren. We moeten echter wel bedenken dat het bij deze methode zo is dat het stukje DNA dat je wilt kopiëren korter is dan de streng die in het vat zit. Je wilt dus eigenlijk een deel van de streng in het vat vermeerderen.

De temperatuur in het vat loopt op tot 94 graden, waardoor de twee strengen van elkaar worden gescheiden. Dit nemen we denaturering. Vervolgens worden er twee primers toegevoegd, dit zijn stukjes DNA die passen op de uiteinden van de twee lossen strengen (dus ze zijn tegenovergesteld aan het stukje DNA waar ze aan vast kunnen gaan zitten). Voorbeeld: bij een streng die eindigt met de code ACG, hoort een primer met de code TGC. Deze stap noemen we de hybridisatie. Als de primers vastzitten, kan DNA-polymerase nieuwe nucleotiden aan de enkele strengen vastplakken, waardoor er weer twee dubbele (identieke) strengen ontstaan. De ketenverlenging vindt plaats vanaf de plaats van de primer, maar doordat deze maar aan één kant zit, gaat de ketenverlenging wel langer door dan nodig is voor het bepaalde stukje DNA wat we willen vermeerderen. Dit kan worden verholpen door de methode nog een aantal keren uit te voeren. De gehele methode wordt zo vaak herhaald herhaald, totdat we precies het stukje DNA hebben dat we wilden hebben en totdat er voldoende kopieën zijn.

DNA-seqencing

Wanneer er voldoende gekopieerd DNA is, kunnen we een methode toepassen om de volgorde van de nucleotiden te bepalen. Dit noemen we DNA-seqentie. We hebben een onbekende streng enkelstrengs DNA (want de strengen zijn gescheiden in de voorbereidingen op deze methode). Deze streng doen we in een vloeistof en we doen er ook deoxyribonuleotiden en dideoxyribonucleotiden bij. Deoxyribonucletiden zijn eigenlijk gewoon (kunstmatige) nucleotiden: dATP (A) - dCTP (C) - dGTP (G) en dTTP (T). Dideoxyribonucleotiden kunnen we noteren als ddATP (A) - ddCTP (C) - ddGTP (G) en ddTTP (T). Aan deze laatste vier wordt een fluoriserend enzym vastgeplakt, zodat we A C G en T uit elkaar kunnen houden door middel van hun kleur. Wanneer er nieuwe nucleotiden aan de enkele streng worden vastgeplakt, om er weer een dubbele streng van te maken, is er altijd keuze uit twee nucleotiden. Óf een deoxyribonucleotide óf een dideoxyribonucleotide. Wanneer er voor de eerste wordt gekozen, is er niets aan de hand en gaat de streng gewoon verder met nucleotiden plakken, maar wanneer er voor de laatste wordt gekozen, stopt de aanhechting van nieuwe nucleotiden. Door deze methode bij heel veel dezelfde strengen uit te voeren, ontstaan er dus allerlei strengen van verschillende lengte (de dideoxyribonucleotiden worden overal wel een keer gekozen, dus de streng zal bij iedere nulceotide een keer stoppen).

Alle strengen DNA van verschillende lengte worden nu in een bak met gel gedaan, zodat er een gel-elektrolyse kan worden uitgevoerd. Met behulp van ladingen, bewegen de strengen van de ene kant van de bak naar de andere kant. Hierbij zijn de korte strengen het snelste en de lange strengen het langzaamste (in verband met gewicht). De snelste streng is dus de streng van maar één nucleotide (dideoxyribonucleotide was daar direct bij de eerste nucleotide al gekozen en de streng stopte daar dus al met de aanhechting van nog meer nucleotiden). Doordat alle dideoxyribonucleotiden een verschillende fluoriserende kleur mee hadden gekregen, is het nu nog een kwestie van aflezen. Stel, die snelste streng licht rood op, en je wist dat je ddATP rood had gemarkeerd, weer je dus dat je te maken hebt met een A. De nucleotide die hier in de oorspronkelijke streng lag, is dus een T (tegenovergesteld aan A). Zo kun je alle strengen op hun plaats in de gel-bak beoordelen, waardoor uiteindelijk de code van je stukje DNA is te achterhalen!

Lees verder

• Molecuul van de twintigste eeuw