InfoNu.nl > Wetenschap > Diversen > De Western blot

De Western blot

De Western blot De Western blot (ook wel een immunoblot genoemd) is een manier om met een antilichaam specifiek een eiwit aan te kleuren. De Western blot werd voor het eerst beschreven in 1981 en sindsdien is het een veelgebruikte techniek in het onderzoek naar eiwitten. Dit artikel beschrijft hoe een Western blot uitgevoerd kan worden en wat we ermee kunnen.

De uitvoering van een Western blot

De uitvoering van een Western blot bestaat uit verschillende stappen: eerst moet er een oplossing van eiwitten gemaakt worden (bijvoorbeeld een cellysaat of een weefselextract). Vervolgens worden de eiwitten op grootte en lading gescheiden door middel van gel-electrophorese. De eiwitten op de gel worden overgebracht op een membraan waarop ze aangetoond kunnen worden met een antilichaam. Hieronder volgt een uitgebreide beschrijving van de verschillende stappen van een Western blot.

1. Voorbereiding van de monsters

In deze stap wil je de eiwitten in oplossing krijgen, hoe je dat doet hangt af van je uitgangsmateriaal. Bij cellen of bacteriën volstaat het in het algemeen om een lysis met een buffer uit te voeren. Bij gisten en schimmels kan het helpen om glasbolletjes aan de lysis-buffer toe te voegen en flink te vortexen, op deze manier gaan de celwanden beter stuk. Bij stukjes weefsel moet eerst de weefselstructuur kapot gemaakt worden bijvoorbeeld door het gebruik van een homogenisator of sonificatie, verder doet ook hier een lysis-buffer zijn werk. Hierna kunnen ook nog door centrifugatie-stappen de extracten van celorganellen gescheiden worden.
Om sommige eiwitten in een weefsel in oplossing te krijgen, zijn speciale behandelingen nodig. Bijvoorbeeld collageen uit de extracellulaire matrix: dit lost alleen op in zuur en sommige collagenen moeten zelfs speciaal losgeknipt worden uit de matrix met pepsine.
Om afbraak van de monsters tegen te gaan door proteases die door de extractie zijn vrijkomen, worden vaak protease- en fosfatase-remmers aan de lysis-buffer toegevoegd. Verder is het belangrijk om de monsters koel te houden, dit voorkomt denaturatie en afbraak van de eiwitten in het extract.

2. Gel-electroforese

In de tweede stap worden de eiwitten gescheiden door middel van gel-electroforese. Het scheiden van de eiwitten gebeurd voornamelijk op grootte.
De meest gebruikte gels voor eiwitten bestaan uit polyacrylamide waarbij er natrium-dodecyl sulfaat (SDS) aan de buffers is toegevoegd. Vandaar dat ook vaak de afkorting SDS-PAGE (natrium-dodecyl sulfaat polyacrylamide gel-electroforese) gebruikt wordt voor eiwit-gels. De secundaire en tertiaire structuren van eiwitten worden afgebroken (denaturatie) door het monster te verhitten in combinatie met een reductor. SDS zorgt ervoor dat de eiwitten in deze gedenatureerde staat blijven en de eiwitten worden ook omgeven door het negatief geladen SDS. Vervolgens worden de negatief geladen eiwitten door de polyacrylamide gel naar een positieve electrode getrokken. Kleine eiwitten kunnen zich makkelijker door de gel bewegen dan grotere eiwitten en hierdoor worden de eiwitten op grootte gescheiden. Het percentage polyacrylamide dat gebruikt wordt, hangt af van de grootte van het eiwit van interesse; grotere eiwitten worden beter van elkaar gescheiden bij een laag percentage polyacrylamide, maar kleinere eiwitten kunnen bij een laag percentage van de gel af lopen.
Vaak wordt er ook een marker meegenomen op gel. Een marker is een mengsel van eiwitten waarvan de grootte bekend is en daar kan dan later de grootte van het eiwit van interesse mee vergeleken worden.

3. Blotten

Vaak wordt de term blotten erg breed gebruikt, maar in feite betekent het niets meer dan het overbrengen wat op gel zit naar een membraan. Dit wordt gedaan om de eiwitten bereikbaar te maken voor het antilichaam. Voor het blotten van eiwiten worden in het algemeen een nitrocellulose of een polyvinylideen difluoride (PVDF) membraan gebruikt. Het overbrengen kan op verschillende manieren, maar blotten door capillaire werking of electroblotten zijn de meest gebruikte.
Met de capillaire werking wordt de gel op een vloeistof gelegd met daarboven het membraan en daarop sterk absorberende tissues. De vloeistof wordt naar boven gezogen door tissues en de eiwitten worden hierdoor meegezogen.
Electroblotten vindt plaats door stroom. De eiwitten zijn nog steeds negatief geladen en door het membraan aan de kant van de positieve electrode te plaatsen, verplaatsen de eiwitten zich op het membraan.

4. Blokken

De membranen die gekozen worden als blot-materiaal kunnen eiwitten zeer goed binden. Antilichamen zijn zelf ook eiwitten en om te zorgen dat er geen interactie plaats vindt tussen het membraan en het antilichaam, moet er geblokt worden.
Bovine serum albumine (BSA) en melkpoeder zijn goedkope blok-producten. De blokker wordt opgelost in tris-buffered saline (TBS) met een klein percentage (meestal 0.1%) tween of triton (detergentia). Door het membraan hierin te incuberen, worden alle plaatsen van het membraan waar nog geen eiwit zit gebonden met BSA of melk. Hierdoor kan het antilichaam niet meer aan het membraan zelf hechten, maar alleen aan het eiwit waartegen het antilichaam gericht is.

5. Detectie

Het is noodzakelijk dat het antilichaam een modificatie heeft om het te kunnen detecteren. Dit hoeft niet per sé het antilichaam gericht tegen het eiwit van interesse (primair antilichaam) te zijn, dit kan ook met een gemodificeerd secundair eiwit. Als het primaire antilichaam opgewekt is in een muis, kan het secundaire antilichaam een gemodificeerd anti-muis antilichaam zijn (bijvoorbeeld een antilichaam opgewekt in geit gericht tegen muis antilichamen, ofwel geit anti-muis).
De modificatie kan bijvoorbeeld bestaan uit een horse radish peroxidase (HRP) of een alkaline fosfatase (AP), deze modificaties kunnen vervolgens aangekleurd worden met een enzymatische reactie (colorimetrisch of chemiluminiscent). Een andere mogelijkheid is een antilichaam met een fluorescent label. Voorheen werd ook wel gebruikt gemaakt van een radioactief label, maar met de komt van niet-radioactieve alternatieven zien we dit meest minder.

6. Analyse

Omdat de grootte van een eiwit afgelezen kan worden aan de hand van de marker, is dit meestal voldoende om een uitspraak te doen of het juiste eiwit aangekleurd is. Antilichaam kunnen ook wel eens aspecifiek binden en in dat geval wordt een ander eiwit aangekleurd. Om een uitspraak te doen of er meer of minder van het eiwit van interesse aanwezig is in de eiwitoplossing, is het belangrijk dat er altijd dezelfde hoeveelheid totaal eiwit op de gel aangebracht wordt. De hoeveelheid totaal eiwit in de eiwitoplossing kan op verschillende manieren bepaald worden, maar omdat er storingen kunnen zijn in deze bepaling of in het blotten zelf, wordt er altijd een ladings-controle meegenomen. De ladings-controle bestaat uit het aankleuren (met een antilichaam) van een eiwit dat altijd in dezelfde hoeveelheid aanwezig is n een cel, bacterie, gist of schimmel. Vaak worden actine, tubuline of GAPDH hiervoor gebruikt.

Wat kunnen we met een Western blot

In het onderzoek wordt vaak een Western blot gebruikt om te kijken of een eiwit aanwezig is en zo ja, of er meer of minder aanwezig is. Ook voor de diagnostiek wordt de Western blot gebruikt, zo zijn bijvoorbeeld HIV, BSE en testen voor de ziekte van Lyme gebaseerd op Western blots.

Weetje

De term Western blot klinkt alsof er ook een Southern, Northern en Eastern blot bestaan. Dit is ook zo. Het blotten werd voor het eerst gebruikt voor DNA en dit was ontwikkeld door Edwin Sourthern, vandaar dat dit de naam Southern blotten kreeg. Vervolgens ging men ook eiwitten en RNA blotten en kregen dit de namen Western en Northern blotten. De Eastern blot is pas recentelijk uitgevonden en deze wordt gebruikt om naar post-translationale modificaties van eiwitten te kijken.
© 2011 - 2019 Luutje, het auteursrecht (tenzij anders vermeld) van dit artikel ligt bij de infoteur. Zonder toestemming van de infoteur is vermenigvuldiging verboden.
Gerelateerde artikelen
Uitslagen Western Blot lymetest interpreterenUitslagen Western Blot lymetest interpreterenWanneer je vermoedt dat je de ziekte van Lyme hebt, kun je een bloedtest laten afnemen. Vaak wordt er dan gekozen voor e…
Zijnskracht - Cruciaal in een evenwichtige opvoedingZijnskracht - Cruciaal in een evenwichtige opvoedingVolgens Paul de Blot (1924) is verstandelijke kennis voor 10 % van belang voor een kind. Relatiekracht vormt 30% en de o…
Eierdooier scheiden: hoe doe je dit handig?Eierdooier scheiden: hoe doe je dit handig?Een eierdooier scheiden is een uitdaging. Bijna heeft weleens een ongelukje gemaakt met de eidooier scheiden van het eiw…
Zelf ijs maken, sorbetijs receptZelf ijs maken, sorbetijs receptWanneer het zonnetje schijnt is er niks lekkerder dan een heerlijke bol sorbetijs, lekker verfrissend en zoet. Zelf gema…
Chocolademousse: klassiek recept en luchtige variantDe klassieke chocolademousse -of simpelweg “chocomousse”- wordt gemaakt met eigeel en soms ook boter, maar je kan ook vo…

Reageer op het artikel "De Western blot"

Plaats als eerste een reactie, vraag of opmerking bij dit artikel. Reacties moeten voldoen aan de huisregels van InfoNu.
Meld mij aan voor de tweewekelijkse InfoNu nieuwsbrief
Ik ga akkoord met de privacyverklaring en ben bekend met de inhoud hiervan
Infoteur: Luutje
Gepubliceerd: 26-05-2011
Rubriek: Wetenschap
Subrubriek: Diversen
Schrijf mee!