Flowcytometrie: differentiatie van de cellen

Flowcytometrie wordt voornamelijk gebruikt voor hematologische diagnose, om zo een eventuele kanker op te sporen zoals leukemie of Hodgkin.

Wat is flowcytometrie?

Flowcytometrie is een techniek voor het tellen en typeren van microscopisch kleine deeltjes in een vloeistof. Hierbij wordt er gebruik gemaakt van fluorescentie. Fluorescentie wordt in het dagelijks leven veel gebruikt. Onder andere bij bankbiljetten of wasmiddel. Ook wordt het veel toegepast in de medische wereld.

Het gebruik van de flowcytometer is een betrouwbare manier van meten. Oorspronkelijk werd dit met behulp van een fluorescentie microscoop gedaan. Dit is echter een arbeidsintensieve techniek waarbij er veel minder cellen worden gezien dan door een flowcytometer. Ook kunnen er met deze handmethode fouten worden gemaakt. Daarom is het betrouwbaarder om met een flowcytometer te werken in plaats van de handmethode met de fluorescentie microscoop.

Bij flowcytometrie worden er diverse waarden gemeten. Dit kunnen fysische celeigenschappen zijn zoals de volume of lengte van de cel. Vervolgens kan er door middel van het optisch/elektronisch detectieapparaat de fysische en chemische eigenschappen van de cel worden gemeten.

Gebruik van flowcytometrie

Flowcytometrie wordt in diverse onderzoeksvelden toegepast. Het wordt onder andere gebruikt bij biologie, immunologie en pathologie. Het wordt het meest toegepast bij hematologisch onderzoek. Als monstermateriaal wordt er bloed of beenmerg gebruikt. Eerst worden de cellen gelabeld met antistoffen gericht tegen CD markers (Cluster of Differentiation). Deze CD markers zijn antigenen die zich op het oppervlak van de cel bevinden. Door de verschillende mate van fluorescentie van de CD markers, kunnen deze onderscheiden worden. Zo kunnen de verschillende soorten cellen aangetoond worden en de aantallen hiervan. Ook bij hematologische maligniteiten kan flowcytometrie van groot belang zijn. Als er sprake is van een hematologisch maligniteit kan het zijn dat er veel jonge cellen zich in het bloed bevinden. Bijvoorbeeld bij leukemie. Ook kan het expressiepatroon van de CD markers veranderen door bijvoorbeeld lymfomen. Dit kan dan ook door middel van flowcytometrie worden gediagnosticeerd en vervolgd.

Het principe van de flowcytometer

De cellen in de vloeistofstroom worden door een bundel laser licht geleid. De verstrooiing wordt door diverse detectoren gemeten. Om te zorgen dat er maar een cel tegelijk langs een detector gaat, wordt er gebruik gemaakt van hydrodynamische focusing. De flowcytometer bevat meerdere detectoren, twee hiervan zijn de voorwaartse scatter (FSC), deze detector zegt iets over de grootte van de cel, en de zijwaartse scatter (SSC), deze zegt iets over de inhoud van de cel. De mate van verstrooiing van het licht is afhankelijk van diverse celeigenschappen, onder andere de grootte, het type, hoeveelheid DNA, chromosomen en diverse eiwitten.

Ook wordt de fluorescentie van de diverse cellen gemeten. Hierbij wordt er gebruikt gemaakt van fluorescerende markers. Voor de meting plaats vindt, worden er diverse specifieke labels met kleurstof toegevoegd aan het patiëntenmateriaal om de CD markersop het celoppervlak te labelen. Deze antigenen kunnen typische kenmerken zijn om een cel te herkennen. Dit wordt ook wel differentiatie genoemd. Sommige antigenen bevinden zich op meerdere soorten cellen en zijn niet specifiek. Wel kunnen cellen een bepaalde combinatie van antigenen bevatten waardoor het wel specifieke differentiatie wordt.

Als de cellen de diverse detectoren passeren, wordt de mate van fluorescentie gemeten. Elke detector meet op een andere golflengte waardoor de diverse CD-markers met toegevoegd labels onderscheiden kunnen worden.

Monoklonale antistoffen

Monoklonale antistoffen zijn antistoffen die ontstaan uit B cellen als reactie op antigenen. Ze zijn van groot belang voor de afweer. De monoklonale antistoffen die gebruikt worden voor flowcytometrie worden via dieren verkregen.

Als eerste wordt er een bepaald antigeen bij een dier (bijvoorbeeld een muis) ingespoten. Dit wordt na 6 tot 12 weken herhaald. Het immuunsysteem maakt antistoffen aan als reactie op de ingespoten antigenen. Deze antistoffen ontstaan uit de B cellen die zich in de milt van het dier bevinden. De milt wordt na drie dagen verwijderd waarna de cellen van elkaar gescheiden worden. De B cellen hebben echter maar een korte levensduur, daarom worden deze cellen samengevoegd met tumorcellen omdat deze snel delen. Er worden door deze B cellen meerdere antistoffen gemaakt, dit noemt men een polyklonaal antiserum. Deze samenstelling van diverse B cellen wil men scheiden zodat er een monoklonaal antiserum ontstaat dat gericht is tegen een soort antigeen. Dit doet men door de cellen te verdelen over een microtiterplaat. Na toevoeging van groeimedium bevat elk putje in de microtiterplaat cellen die één soort antistof produceren tegen één antigeen. Nu spreekt men van een monoklonaal antistof. Ten slotte wordt er een selectie gemaakt van de cellen die nodig zijn, deze cellen worden verder gekweekt om vervolgens gebruikt te kunnen worden bij de flowcytometrie.