De ontwikkeling van humaan monoclonaal antilichaam

In dit artikel wordt uiteengezet hoe faagexpositie gebruikt wordt voor het opstellen van antilichaamfragmentbanken en de ontwikkeling van een humaan monoclonaal antilichaam.

Inleiding en probleemstelling

Monoclonale antilichamen (MoAb) worden in de klinische biologie voornamelijk gebruikt in diagnostische analyses voor het aantonen van zwangerschap, pathogene infecties en de aanwezigheid van drugs in het bloed. Antilichamen worden eveneens gebruikt bij de vergelijking van histocompatibiliteitsantigenen en voor de detectie van tumorantigenen (Kuby, 1997). Anderzijds worden ze gebruikt als therapeutische agentia m.n. bij passieve immunisatie waarbij vooraf gevormde antilichamen als behandeling van een infectie in het lichaam worden geinjecteerd. Het kan eveneens levens redden indien toxines in het lichaam circuleren zoals tetanustoxine, difterietoxine en slangengif (Brostoff et al., 2000). MoAb worden nog hoofdzakelijk bekomen uit knaagdier-hybridomacellen.

Alhoewel deze antilichamen makkelijk te synthetiseren zijn, worden ze in het menselijk lichaam als vreemd herkend wat resulteert in een immuunrespons (IR) zodanig dat ze afgebroken worden vooraleer ze hun functie uitgevoerd hebben (Kuby, 1997; Rapley and Walker, 1998; Brostoff et al., 2000). De ontwikkeling van chimeren en heteroconjugaten door antilichaam ‘engineering’ leverde een mogelijke oplossing. Deze constructen bleken echter in het menselijk lichaam nog steeds een IR op te wekken (Rapley and Walker, 1998).

Door de opkomst van ‘antilichaam faagexpositie’, ontstond de mogelijkheid om in eucaryotische expressiesystemen, een volledig humaan antilichaam met hoge specificiteit voor een bepaald antigeen te synthetiseren (Rapley and Walker, 1998; Liang et al. 2001).

Faagexpositie en aanmaak van antilichaamfragmentbanken

De variabele of V domeinen van de zware (VH) en de lichte (VL) keten, is al wat nodig is om een antigeen te kunnen binden. Meer specifiek zijn het de 'complementarity-determining regions' (CDRs) die instaan voor antigeenbinding en vertonen de grootste variabiliteit in een antilichaammolecule. Het zijn deze fragmenten die kunnen gepresenteerd worden op de buitenmembraanproteïnen pIII (minor) en pVIII (major) van filamenteuze bacteriofagen. De fragmenten kunnen d.m.v. een korte peptidenlinker (tot scFv fragmenten) of d.m.v. een disulfidebrug (tot dsFv fragmenten) aan elkaar gekoppeld worden. Anderzijds kunnen ook de volledige Fab fragmenten op deze bacteriofagen gepresenteerd worden (Rapley and Walker, 1998; Kotermann and Dübel, 2000; Rondot et al., 2001).

Rondont en medewerkers (2000) toonden aan dat het grootste rendement aan antilichaamfragmenten bij faagexpositie, kan bekomen worden door gebruik te maken van een hyperfaag. Deze hyperfaag werd aangemaakt in Escherichia coli DH5a isolaten (Figuur 2). In een eerste stap wordt het genoom van E. coli d.m.v. elektrotransformatie met het M13 pIII gen getransformeerd. Dit pIII gen staat in voor de aanmaak van faagpili. Na een tweede transformatie met het deficiënte M13KO7ÑpIII gen in het E. coli F+ plasmide, ontstonden de DH5a/pIII[M13KO7ÑpIII] isolaten. Vermits het M13 pIII gen in trans geleverd wordt, produceren deze bacteriën o.i.v. van de inducer isopropyl-b-D-thiogalactosidase (IPTG) hyperfaag virions. Een hyperfaag heeft dus het wildtype pIII fenotype waardoor ze instaat is om E. coli F+ cellen met hoge efficiëntie te infecteren maar niet om zich te reproduceren. E. coli isolaten met een humaan scFv fragmentbank in pSEX81 vector, werden aangemaakt en geïnfecteerd met hyperfaag. Deze E. coli produceren scFv exposerende fagen[pSEX81] vector.
De aanmaak van een antilichaamfragmentenbank gebeurt aan de hand van een proces beter gekend als keten ‘shuffling’ (Rapley and Walker, 1998). In een keten ‘shuffling’ bank wordt ofwel de VH of een VL keten behouden terwijl de partner vervangen wordt door een repertoire van verschillende ketens.

Andere technieken zijn ad random mutagenese en ‘site-directed’ mutagenese. De eerste techniek maakt gebruik van ‘doped’ oligonucleotiden die op willekeurige plaatsen in een gen of gensegment mutaties veroorzaakt waardoor het aantal verschillende antilichaamfragmenten sterk verhoogd wordt. Anderzijds kunnen er bij ‘site-directed’ mutagenese op specifieke plaatsen in het DNA mutaties aangebracht worden (Kotermann and Dübel, 2000; Rondot et al., 2001).
In een faagantilichaam expositiebank kunnen meer dan 1010 antilichaamfragmenten elk met een verschillende bindingsaffiniteit voor één antigeen aanwezig zijn. Een veelvuldig gebruikte selectiemethode is ‘panning’ waarbij de faagbank in een met antigeen gecoate tube wordt geïncubeerd. De klonen met hoge en lage specificiteit zullen het antigeen binden. De tube wordt enkele malen gewassen om niet-specifieke klonen te verwijderen. Na de wasstap kunnen de klonen d.m.v. een lichte denaturatiestap van het antigeen geëlueerd worden. Deze fagen worden vervolgens gebruikt voor de infectie van E. coli F+ isolaten. Op deze manier bekomt men een nieuwe populatie van faagexposerende cellen. Dit proces wordt enkele malen herhaald zodat men finaal een populatie fagen bekomt die met hoge affiniteit het antigeen binden. Het nadeel van deze techniek is dat het antigeen conformationele veranderingen kan ondergaan wanneer het op een vaste drager gebonden is. Eveneens is de binding van de fagen aan het geïmmobiliseerd antigeen diffusiegelimiteerd. Het gebruik van oplosbaar gebiotinyleerd antigeen kan deze problemen omzeilen. De fagen die het specifiek antigeen binden, worden m.b.v. streptavidinegebonden magnetische parels uit de oplossing gevangen (Dübel et al., 1995).
De Ab-fragmentgenen uit de opgezuiverde fagen kunnen nu gebruikt worden voor de aanmaak van een volledige humaan MoAb, waarbij vb. de Fab fragmenten dienen gekoppeld te worden aan de Fc domeinen van een humaan antilichaam. Recombinant E. coli is niet bruikbaar voor de productie van intact MoAb vermits ze geen posttranslationele modificaties van proteïnen toelaten. In plaats daarvan gebruikt men baculoviruscassette vectorsystemen die insektcellen gaan infecteren en het humaan antilichaam tot expressie brengen (Liang et al., 2001).