Kwantitatieve moleculaire technieken

Kwantitatieve moleculaire technieken worden al geruime tijd gebruikt bij het biochemische en medische onderzoek. Tegenwoordig worden deze technieken ook steeds vaker gebruikt bij de medische diagnostiek. De belangrijkste moleculaire technieken, zoals PCR, zijn in dit artikel beschreven.

Inleiding

Op dit moment kan er een onderverdeling worden gemaakt in twee groepen technieken om RNA en DNA kwantitatief te bepalen (dus de exacte hoeveelheid bepalen):

• Signaalamplificatie technieken
• Target-amplificatie technieken

Signaalamplificatie technieken

Bij deze techniek wordt een hoge gevoeligheid verkregen door het hybridisatiesignaal te versterken, zonder dat er een in vitro vermenigvuldiging van het target DNA of RNA plaatsvindt.

Branched DNA-techniek
Deze techniek wordt uitgevoerd met een 96 well plaat waarbij incubatie- en wasstappen automatisch uit te voeren zijn.

• Het target microorganisme (bijv HIV-1) wordt gelyseerd.
• Het target DNA of RNA van het organisme komt in oplossing en wordt weggevangen door de oligonucleotides, die aan de wand van de welletjes zijn gehecht (zogenaamde capture extender CE)
• Er worden meerdere CE’s gebruikt om het genoom op verschillende plaatsen te binden.
• Om een krachtig signaal te kunnen maken, worden er een aantal zaken gekoppeld aan het target DNA of RNA.
• Een label-extender (LE), een pre-amplifier en een amplifier veroorzaken een soort van “kerstboomeffect” met veel vertakkingen.
• Hieraan worden gelabelde oligonucleotides gebonden.
• Door een enzymatische reactie ontstaat luminescentie, dat kan worden gemeten in een luminometer.
• Deze test heeft een kunnen 200 000 kopieën per ml oplossing worden gedetecteerd (kan verlaagd worden door het monster te centrifugeren).

Hybrid Capture Techniek
Deze techniek is gebaseerd op het het specifiek herkennen van een RNA:DNA hybride door een monoklonaal antilichaam.

• Na het lyseren van het target virus komt het DNA vrij in oplossing.
• Dit kan na denaturatie vrij in suspensie hybridiseren aan een synthetisch RNA-molecuul.
• Het ontstane RNA:DNA hybride kan worden weggevangen door een monoklonaal antilichaam dat specifiek hiervoor is en gehecht is aan de wand van een microtiterplaat of plastic buis.
• Daarna wordt een tweede monoklonaal gebruikt dat die dezelfde hybride herkent.
• Dit monoklonaal is gelabeld en kan worden gemeten met chemiluminescentie. Deze test heeft een kunnen 6000 kopieën per ml oplossing worden gedetecteerd.

Targetamplificatie technieken

Bij targetamplificatie technieken wordt de hoeveelheid target-sequentie vergroot.

NASBA
De Nucleic Acid Sequence Based Amplification techniek is een isotherme (= met gelijke temperatuur) targetamplificatietechniek. Omdat er ook een reverse transcriptase wordt gebruikt is deze techniek zeer geschikt voor RNA.

• Als eerste bindt er een primer aan het RNA
• Deze primer heeft aan de 5’-uiteinde een T7 RNA polymerase sequentie.
• Na reverse transcriptase heeft het verkregen cDNA een T7 RNA promotor sequentie.
• Met behulp van RNAse H wordt het target RNA van dit complex afgekoppeld.
• Er volgt een aanhechting van een tweede primer en het reverse transcriptase zal hiervan een dubbelstrengs DNA streng maken.
• Het R7 RNA polymerase zal vervolgens opnieuw target RNA-moleculen binden.
• Het proces herhaald zich telkens zodat het target materiaal wordt vermeerderd.
• Om de hoeveelheid te bepalen wordt gebruik gemaakt van zogenaamde kalibratoren (Qa, Qb en Qc).
• Van deze kalibratoren kan de concentratie worden vastgesteld, en zo ook de hoeveelheid RNA.

Polymerase kettingreactie of PCR
Er zijn twee manieren om met behulp van PCR een kwantitatieve analyse te maken:
PCR met een verdunningsreeks waarbij elke seriële verdunningsreeks wordt geamplificeerd.
Competitie PCR:

• Een interne standaard wordt meegenomen in de PCR en wordt ook geamplificeerd. Een voordeel hiervan is dat deze methode voor RNA als DNA gebruikt kan worden. Een nadeel is dat een groot aantal reacties nodig is om slecht één uitslag te verkrijgen en dat voor elke test een aparte competitor moet worden geconstrueerd. Deze methode is zeer nauwkeurig.
• Eén reactie wordt uitgevoerd met een vaste bekende hoeveelheid competitor.

Real time PCR

Real time PCR wordt de PCR reactie vervolgd tijdens de reactie zelf en is er inzicht mogelijk in de kinetiek van iedere individuele reactie.

• Een real time PCR verloopt volgens een tweestapsprotocol met normale primers en een TaqMan-probe die tegelijkertijd aan de template hecht.
• Aan deze probe bevindt zich aan het 5’-uiteinde een quencher en een reporter-fluorochroom, die met behulp van extra energie van een laser, energie afstaat bij een bepaalde golflengte (wordt ook wel FRET genoemd).
• Na het uitsmelten van het amplimeer tijdens een PCR-reactie zullen zowel de primers als de TaqMan-probe met zijn reporter en quencher hybridiseen op het enkelstrengs template DNA tijdens de aanhechtingsfase.
• Door het enzymatische afbreken van de TaqMan-probe door de Taq-DNA-polymerase ontstaat vrij fluorochroom en dit zal zijn energie niet meer aan de quencher kunnen afstaan, zodat het gedetecteerd kan worden.

Molecular Beacons
Molecular Beacons zijn enkelstrengs oligonucleotiden die in staat zijn om een dubbelstrengs DNA-structuur te vormen, waarbij in de haarspeldlus de specifieke sequentie zit die complementair is aan het target.

• Aan deze oligonucleotide zit aan de ene zijde een luorochroommolecuul gekoppeld en aan de andere zijde een quencher.Deze quencher dooft de fluorescentie uit
• Na hybridisatie aan het target neemt de afstand tussen de reporter en de quencher toe, zodat het reporter molecuul waarneembaar is als een baken (beacon)

Standaardisatie

Een van de grote problemen die bij kwantificeren optreedt heeft te maken met de standaardisatie van de testsystemen. Hier zijn internationaal nog geen afspraken over gemaakt, behalve over de kwantificering van bloedoverdraagbare virusinfectie, waarover mondiale afspraken zijn gemaakt om een gouden standaard te definiëren.