De groene PCR, toepassingen in de sierteelt

Moleculaire diagnostiek wordt steeds vaker gebruikt in de mediachediagnostiek. Dat PCR tegenwoordig vaak gebruikt wordt bij de sierteelt is velen nog onbekend, vandaar dit artikel.

Inleiding

Bij sierteelgewassen zijn kwaliteit en gezondheidstoestand erg belangrijk. Voor siergewassen die vegetatief worden vermeerderd is de kwaliteit van het uitgangsmateriaal bepalend voor de kwaliteit van de latere, veelal grote, productie. De plant blijft door deze vegetatieve vermeerdering, denkend aan spontane mutaties, onveranderd (voordeel).

• Vegetatief = Hoofdzakelijke verrichtingen van mensen, dieren en planten.
• Vegetatieve functies = Bloedsomloop, spijsvertering, ademhaling, voortplanting etc.

Een nadeel van deze methode is dat (virus) ziekten ook overgedragen kunnen worden op de nakomelingen. Bijv. bij tulpen met een virus, werden vroeger miljoenen voor neergelegd in Japan en nu hebben ze deze tulpen liever niet meer, vanwegen eventuele virus verspreidingen. Jaarlijks worden miljoenen planten en bloembollen getoetst door keuringsdiensten. Er bestaat tegenwoordig steeds meer behoefte aan toetsen die specifieker en gevoeliger zijn. Deze testen zijn o.a. Nodig, vanwege plant-pathogene die vaak latent (symptoomloos) aanwezig zijn, kunnen ontsnappen aan serologische detectie.

Soort- en cultivarherkenning bij siergewassen

In de tuinbouw en sierteelt is het identificeren en het onderscheiden van plantencultivars erg belangrijk.

• Cultivable (Eng) = bebouwbaar
• Cultivate (Eng) = bouwen, bebouwen, bewerken, verbouwen, (aan)kweken, telen.

Voor bolgewassen duurt het minstens 15 tot 20 jaar om nieuwe cultivars te ontwikkelen (erg lang dus) en het uiteindelijk op de markt te brengen. Dit word in verband gelegd met vermeerdering tot verhandelbaar van (grote) partijen.

DNA-technieken kunnen toegepast worden om plantensoorten of cultivars te herkennen. Een groot voordeel is dat ze direct op genetisch niveau werken. In tegen stelling tot biochemische technieken die slechts naar expressie van delen van het genoom kijken.Eiwitexpressie is onder meer afhankelijk van het (planten)orgaan, leeftijd, omstandigheden en de bearing van het monster, zodat onderlinge vergelijking wordt bemoeilijkt. Wanneer er geen sequentie gegevens bekend zijn, lijkt DNA-fingerprinting de angwezen methoden: unieke DNA-fragmentpatronen leveren bewijs van de identifiteit van een bepaalde plantensoort. DNA-fragmenten die gekoppeld zijn aan bepaalde eigenschappen van planten, als kleur, smaak, resistentie tegen bepaalde ziektes, kunnen zo geïsoleerd en gekarakteriseerd worden.

Kleine weefseltechnieken kunnen somato-klonale variaties tot gevolg hebben. Somato-klonale variaties = mutaties specifiek veroorzaakt door weefselkweek. Via een RAPD-analyse kan dit niet aangetoond worden, het bestrijkt in de meeste gevallen (veel) te weinig van het plantengenoom. Bij een hoge uitzondering is een puntmutatie te detecteren met een RAPD-analyse. Dezelfde bezwaren komen voor bij een transformatie. Gevolg van transformatie kan zijn dat er geen andere veranderingen in het genoom zijn opgetreden.

Identificatie van bodemschimmels die bolgewassen aantasten: ITS-RFLP

Het genus (geslacht) Pythium vormt een groep van bodemschimmels die veel schade aan cultuur gewassen kan toebrengen. Deze schimmel tast het wortelstelsel aan (wortelrot) met een nadelige invloed op de grooi van de gastheerplant.

Zo wordt er momenteel onderzoek gedaan naar welke Pythium-soorten pathogeen zijn voor bolgewassen als tulp, krokus, hyacint en iris. De determinatie van deze schimmel is moeilijk vanwege sommige karakteristieken zoals, sporen of geslachtsorganen die niet altijd aanwezig of variabel zijn. Daarom is ereen selectie van 25 verschillende Pythium-soorten gemaakt en de DNA-technieken kunnen dan voor een snelle identificatie zorgen. De opzet (van de studie) was gericht op amplificatie en analyse van de variabele intergenic transcribed spacer (ITS) gebieden en met behulp van restrictie-enzym analyse (RFLP) het opsporen van de soorten-specifieke karakteristieken.

De schimmels zijn geïdentificeerd op grond van vastgestelde taxonomische (ordenen) karakterestieken.
ITS – gebieden = zijn variabele niet-coderende repetitieve sequenties die de sterk geconserveerde ribosomale sequenties verbinden.
Om ribosomaal DNA van schimmels te herkennen zijn de primers ITS4 en ITS5 ontwikkeld. Deze primers amplificeren (vergroten) tijdens het PCR het 5.8S rDNA inclusief de flankerende ITS-gebieden.
DNA werd verkregen uit schimmeldraden van individueel opgekweekte Pythium-soorten. Uiteindelijk (na PCR) leverde de DNA-fragmenten tussen de 800 tot 1150 bp op --> vervolgens wordt het geknipt met verschillende restrictie-enzymen --> leveren verschillende RFLP-patronen op, maar ook een aantal die nauw verwant zijn.
↓
→De verkregen RFLP-patronen worden via een scanner ingelezen en met speciale software gebruikt als referentie-fingerpints om nog onbekende isolaten mee te matchen → hierdoor konden er weer specifieke primers ontworpen worden.
De streepjescode typering van de Pythium-soorten in bolgewassen wordt gebruikt in combinatie met een softwarepakket waarin de referentie-fingerpints per Phytium-referentiestam en per restrictie-enzym zijn opgeslagen. De computer komt dan met een procent (van 0 tot 100%) aantal overeenkomst.

Toch geldt dit niet voor alle Phytium-soorten, die hebben een andere determinatie nodig, vanwege de voorkoming van honderden Pythium-soorten. Gelukkig komen ze niet in alle plant- en bolgewassen voor.

Fusaruim oxysporum forma specialis gladioli (Fog) is een schimmel die de wortels aantast van de gladiolenknol en van andere iris-achtigen. De schimmel veroorzaakt verwelking van de plant en Fog kan grote schade veroorzaken in de gladiolenteelten voor bloem- en knolproductie. Er was dringend een toets nodig om te kunnen vaststellen of latente Fusarium infectie aanwezig id in knollen van grootbloemige gladiolen. Het ontsmetten van knollen is niet afdoende en het gebruik van fungiciden wordt steeds meer aan banden gelegd.

Een certificatiesysteem voor grootbloemige gladiolen via een toetsingsprotocol zou van groot economisch belang zijn. Een laboratoriumtest, gebaseerd op selectieve isolatie van pathogene Fog uit fijngemaakte grootbloemige knollen bleek niet specifiek genoeg. Er groeiden ook niet-pathogene Fog uit alsmede isolaten die alleen kleinbloemige gladiolen kunnen aantasten. Deze waren niet te onderscheiden van de schadelijke Fog. De opdracht was dus een toest te ontwikkelendie selectief en gevoelig pathogene Fog kan aantonen in knolmateriaal. Van 120-tal Fog’s en andere schimmelsoorten werd DNA geisoleerd op standaardwijze.

Er was niets bekend over verschillen op eiwit of DNA niveau tussen de verschillende fysio’s van Fog, daarom werd gekozen voor de RAPD-analyse. Twee RAPD-primers gaven verschil aan tussen de pathogene en niet-pathogene Fog. RAPD-PCR werd op standaardwijze uitgevoerd met ongeveer 100 ng schimmel DNA als matrijs met een anneling-temperatuur van 37oC. Aan de hand van dit verschil is met behulp van inverse-PCR en nieuwe diagnostishce test ontwikkeld.

Een alternatieve ‘at random’ DNA-methode die recent is ontwikkeld, is de zogeheten amplification fragment length polymorphisme (AFLP) analyse. Deze analyse is uitgevoerd op een aantal ‘Fog’ isolaten na knippen van schimmel DNA met HindIII en ligatie van selectieve adapters. Na amplificatie die door de adapters worden gegenereerd. De AFLP-techniek is bewerkelijker dan RAPD, maar levert meer verschillen op tussen groepen van organismen en leidt in potentie sneller tot de selectie van diagnstisch bruikbare DNA-merkermolculen.

De discriminerende multiplex PCR-test op pathogene Fog in gladiolenknollen is ontwikkeld voor praktisch gebruik door de keuringsdienst. Deze toest duurt ongeveer vijf dagen; direct PCR op knolmateriaal was niet mogelijk door remming van knolmateriaal en preincubatie is noodzakelijk in verband met de biologische uitgroei van lantent aanwezig infectieus materiaal.

Detectie van geelziektebacteriën in de hyacint: van specifieke eiwit naar specifieke PCR-primers

De bacterie Xanthomonas hyacinthi, bekent als geelziektebacterie, tast hyacinten aan via huidmondjes en wondjes (bijvoorbeeld door hagelschade) en kan gemakkelijk via wind en regen worden verspreid. Door zijn snelle verspreiding en schade aan blad en bloem is deze bacterieziekte een groot probleem voor de hyacintenteler.

Een gevoelige, snelle en specifieke toets was gewenst. Een aantal jaar geleden zijn monoklonale antistoffen ontwikkeld tegen een specifiek oppervlakte eiwit van deze bacterien en toegepast in een ELISA-test. Ongeveer 500.000 bacterien zijn onder optimale omstandigheden aantoonbaar; in de praktijk (in plantenmateriaal) ligt de detectiegrens hoger. Een gevoelige, snellere en specifiekere methode was daarom gewest om onder meer eerste bladsymptomen te kunnen aantonen om zo verspreiding van de bacterie te voorkomen. Daarom werd een PCR ontwikkeld.

Een eiwit met unieke sequentie werd gevonden. Om nu de corresponderende gensequentie, coderend voor één subeenheid van even grote grootte in handen te krijgen is het moeglijk een zogenoemde genbank van X hyacinthi in E coli te maken. In dit geval is de strategie gedegeneerde primers te ontwerpen aan de hand van aminozuursequenties van het subunit eiwit uit de baceriele fimbriae. De verkregen primerset is niet alleen getest op vele soorten en subsoorten Xanthomonas, maar ook op andere bacteriesoorten. De PCR bleek specifiek en alleen X hyacinthi te herkennen. Het protocol is aangepast om op bolmateriaal uitvoerbaar te zijn. De PCR-methode bleek een factor 100 tot 1000 gevoeliger tot zin dan de ELISA-methode.

Toekomstige ontwikkelingen

Momenteel is er een toename van de toepassing van AFLP, met name voor de identificatie van merkers die gecorreleerd zijn met gunstige eigenschappen van de te onderzoeken plant.