Aanmaak van synthetische peptiden

Tijdens de ‘solid-fase’ peptide synthese of SPPS worden de proteïnen uitgaande van aminozuren gesynthetiseerd op een vaste drager of resin. De techniek wordt gebruikt voor de aanmaak van kleine eiwitten die via recombinante expressiesystemen moeilijk te bekomen zijn. Zo zijn we er in geslaagd om verscheidene peptidefragmenten aan te maken waaronder het tripeptide QPG en het neutrofiel chemotactisch proteïne (NCP) bestaande uit 12 aminozuren.

Algemeen

Er bestaan twee mogelijke strategieën voor SPPS eiwitsynthese die gebaseerd zijn op Fastmoc (9-fluorenylmethoxycarbonyl) en Boc (t-butyloxycarbonyl) beschermgroepen. We zullen enkel gebruik maken van de SPPS gebaseerd op Fmoc die de a-aminogroep van aminozuren beschermt.

Een a-amino beschermgroep van een aminozuur, een Fmoc groep, wordt verwijderd aan het begin van elke cyclus van de algemene Fmoc chemie voor SPPS, d.m.v. een secundair amine, meestal 20% piperidine. Na deprotectie (verwijdering van de Fmoc) wordt de resin gewassen met NMP (N-methyl-morpholine) om het piperidine te verwijderen. De peptide-resin is nu klaar voor koppeling. Vóór de koppelingsreactie dient de carboxylgroep van het aminozuur geactiveerd te worden. Voor de Fmoc chemie bestaan er twee wegen van activatie m.n. de HBTU en de HOBt/DCC weg. Activatie met HBTU is ook gekend als de FastMoc chemie. Tijdens de koppelingreactie reageert het geactiveerde Fmoc aminozuur met de groeiende peptideketen om een peptidenbinding te vormen. Wanneer de koppeling beëindigd is wordt de resin gewassen in NMP. De deprotectie- en de koppelingstappen van elk aminozuur worden herhaald totdat de ketenverlenging efficiënt beëindigd is.

Resinkeuze

In de Fmoc chemie wordt het peptide gesynthetiseerd beginnende met de C-terminus naar de N-terminus met de a-carboxylgroep vastgehecht aan de resin. We kunnen zowel ongelabelde als voorgelabelde resins gebruiken zoals Fmoc-Asp (a-OtBu) en Fmoc-Glu (a-OtBu) waarbij reeds een aminozuur aan de resin is vastgehecht. Meestal verkiezen we de ongelabelde resins zodat we het eerste aminozuur zelf kunnen bepalen zonder substituties van het reeds aanwezige aminozuur door te voeren wat de reactie enigszins versnelt.

Er bestaan verschillende soorten resins m.n. HMP resin (carboxylzuur terminaal peptide), amide resin (amide terminaal peptide) en de super zuur-gelabelde resins (beschermen zijketens met een carboxylzuur terminaal peptide). Voor de Fmoc procedure gebruiken we de amide resin waarbij het terminaal amine beschermd is door een Fmoc groep. Deze Fmoc groep wordt voor elke koppelingsstap m.b.v. piperidine/NMP verwijderd.

Deprotectie

De eerste stap in de eiwitsynthese is deprotectie of verwijdering van de Fmoc beschermgroep d.m.v. een base nl. piperidine. Na deprotectie wordt het volgende aminozuur gekoppeld aan het amino-uiteinde van het gedeprotecteerde aminozuur waardoor een peptidenbinding ontstaat. Ketenverlenging bestaat dus uit een serie van deprotecties en aminozuurkoppelingreacties. Conductiviteitopmetingen volgen het verloop van de deprotectie door de conductiviteitwaarden van twee stalen met elkaar te vergelijken waarbij het verschil tussen de twee waarden kleiner moet zijn dan de vooropgestelde waarde. In het andere geval wordt de conductiviteit van het eerste staal vergeleken met het laatste staal en deze waarde dient eveneens lager te zijn dan het vooropgestelde percentage, zoniet wordt de koppeling- en de deprotectiestap herhaald.

Activatie

Voor dat koppeling kan optreden, dient de carboxylgroep van het volgende aminozuur geactiveerd te worden om te kunnen binden met de gedeprotecteerde (Fmoc afgekliefd) peptide-resinketen. Zowel de HBTU als de HOBt/DCC activatie kunnen hiervoor aangewend worden.

FastMoc protocol (HBTU)
De aminozuren worden geactiveerd met HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium phosphohexafluoride) ter vorming van een HOBt ester en een tetramethyl urea. Tijdens de activatiestap van 0,25 mmol en 0,10 mmol FastMoc cyclus wordt 1,0 mmol droog aminozuur (met beschermgroepen) in de ‘cartridge’ in een oplossing van HBTU, DIEA (diisopropylethylamine) en HOBt in DMF (additioneel met NMP) opgelost. De Fmoc aminozuuroplossing wordt bijna onmiddellijk geactiveerd en tenslotte naar het reactievat getransporteerd waar de aminozuren zullen gekoppeld worden met de groeiende peptide-resin.
Fmoc/HOBt/DCC protocol
De HOBt activatie is zeer nuttig voor de activatie van onbeschermde arginine, glutamine en arginine. Tijdens de activatiestap wordt 1,0 mmol droog aminozuur (met beschermgroepen) in de ‘cartridge’ in een oplossing bestaande uit NMP en 1ml van 1M HOBt (1-hydroxybenzotriazole) in NMP opgelost. Vervolgens wordt deze oplossing getransporteerd naar het activatievat waar nog eens 1 ml van een 1M DCC (N, N’-dicyclohexylcarbodiimide) in NMP wordt toegevoegd. Na 40 tot 50 minuten incubatie wordt het geactiveerde HOBt ester (geactiveerde aminozuur) getransporteerd naar het reactievat terwijl het DCU (N, N’-dicyclohexylurea) precipitaat in de activatievessel achterblijft.

Indien men gebruik maakt van twee equivalent aminozuren t.o.v. één equivalent DCC, ontstaat er een symmetrisch anhydride samen met het DCU product. Het nadeel van deze methode is dat het symmetrisch anhydride dehydratatie van de amiden naar nitrillen veroorzaakt. In een aantal gevallen kan deze eveneens aanleiding geven tot de vorming van lactam (cyclisatie) waardoor deze methode minder frequent gebruikt wordt.

Koppeling

In deze stap wordt het geactiveerde aminozuur gekoppeld aan het gedeprotecteerde amino-terminaal gedeelte van de groeiende peptideketen. De koppelingsefficiëntie dient minimum rond de 99,0% te liggen. Tijdens de eerste minuten wordt een efficiëntie van 99% bereikt maar deze waarde daalt echter snel naargelang de reactie verder verloopt zodat de uiteindelijke koppelingstijd kan oplopen van 10 minuten tot enkele uren. De lage efficiëntie kan veroorzaakt worden door een lage oplosbaarheid van het peptide-resin of kan afhankelijk zijn van de peptidensequentie die aanleiding kan geven tot waterstof-bruggen waardoor peptidenaggregaten gevormd worden die de verdere koppeling verhinderen. Zowel DMF, NMP (N-methyl-morpholine) en DMSO (dimethylsulfoxide) kunnen deze ongemakken in zekere zin verhelpen. Een manier om de koppelingefficiëntie te bepalen is met de kwantitatieve ninhydrine metingen.

Klieving

Eenmaal dat het peptide gesynthetiseerd is, dienen de beschermgroepen en de resin van het peptide gescheiden te worden. Hierbij spelen de reactietijd, de temperatuur, de keuze van de beschermgroepen en de gebruikte klievingsenzymes een belangrijke rol. De klieving verloopt in twee stappen waarbij eerst de Fmoc groep van het peptide afgekliefd wordt en vervolgens de beschermgroepen op de zijketens samen met de resin.

Fmoc klieving

Door het overeenkomstige programma in te stellen, kan men na de synthesereactie een automatische klieving van de Fmoc groep doorvoeren door gebruik te maken van DMF/NMP-HOBt.

In het andere geval zal men de Fmoc groep manueel verwijderen. Het protocol verloopt als volgt:

• Breng de peptide-resin over in een falcon en voeg 20% (v/v) piperidine in NMP (of DMF) toe. De standaard hoeveelheid is 2 ml/50 mg peptide-resin.
• Schud gedurende 20-30 minuten op kamertemperatuur. Filtreer de suspensie en was hetgeen dat achterblijft op de filter eerst verschillende malen met NMF of DMF en vervolgens enkele malen met DCM/MeOH oplossing. Gebruik DCM voor de finale was.
• Droog de peptide-resin gedurende ten minste 3 uur (best overnacht) in vacuüm.

Klieving van de resin en beschermgroepen

Enkele aminozuren met beschermgroepen zijn: Arg (Mtr), Gln (OtBu), Thr (tBu), Asn (Tmob), Lys (Boc), … . Soms kunnen voor hetzelfde aminozuur verschillende beschermgroepen gebruikt worden. Deze beschermgroepen verhinderen dat zijketens gaan plooien en onderling covalente bindingen gaan vormen. Anderzijds verhinderen ze dat de aminozuren die tijdens de ketenverlenging worden toegevoegd, op de zijketens gaan binden.

De overeenkomstige klievingmengsels zijn:

Klievingmengsel A:

• 0,5 ml D.I. water
• 9,5 ml TFA

Klievingmengsel B:

• 0,75 ml fenol
• 0,25 ml EDT
• 0,5 ml thioanisole
• 0,5 ml D.I. water
• 10 ml TFA

Klievingmengsel C:

• 0,25 ml EDT
• 0,25 ml D.I. water
• 9,5 ml TFA

Afhankelijk van het gebruikte klievingmengsel wordt een verschillend protocol uitgevoerd (Zie handleiding: Introduction to Cleavage Techniques; copyright 1990 Applied Biosystems, Inc.). We hebben bijvoorbeeld gebruik gemaakt van procedure II en klievingmengsel B.

Methode
Voeg aan het eiwit 10 ml klievingmengsel waardoorheen N gas gaat en laat gedurende 1 uur 30 op kamertemperatuur incuberen. Filtreer de suspensie doorheen een glasfilter (met behulp van vacuüm) in 40 ml koude methyl t-butyl ether (MTBE). De resin blijft op de filter achter en de proteïnen migreren doorheen de filter. Spoel de filter met 3 x 500 µl TFA. Centrifugeer de eiwitoplossing gedurende 10 minuten op 3000 rpm en was vervolgens met 30 ml MTBE. Herhaal de vorige stap 5 tot 6 maal. Los het peptide op in 0,5 ml milli-Q water voor lyofilisatie.

LIJST VAN AFKORTINGEN

• DMF dimethylformamide
• DMS dimethyl sulfide
• DMSO dimethylsulfoxide
• DCC N, N’-dicyclohexylcarbodiimide
• DCU N, N’-dicyclohexylurea
• Fmoc 9-flouenylmethyloxycarbonyl
• HBTU 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium phosphohexafluoride
• HOBt 1-hydroxybenzotriazole
• MTBE methyl t-butyl ether
• NMP N-methyl-morpholine
• OtBu teriar-butyl ester
• PBMC perifere bloedmononucleaire cellen
• t-Bu tertiar-butyl
• TFA trifluorazijnzuur