Eiwitkristallografie en X-stralen diffractie

Eiwitkristallisatie gekoppeld aan X-stralen diffractie is al lange tijd de standaard voor de structuurbepaling van eiwitten. Eiwitten vouwen op in complexe vormen, zoals alfa helices en beta sheets (secundaire structuur), die op zich ook nog eens combineren tot een nog complexere structuur (de tertiaire structuur). Aan de hand van perfecte eiwitkristalletjes kan men via X-stralen diffractie de electronendensiteit van het eiwit in kaart brengen om zo de structuur te achterhalen.

Eiwitkristallografie

• Inleiding
• Theorie van kristalgroei
• Methoden voor kristalgroei
• Alternatieve methoden voor kristalgroei
• Gevorderde methoden voor kristalgroei
• Te screenen parameters
• Een eiwitkristal

Inleiding

In de laatste 20 jaar heeft X-stralen kristallografie enorme stappen voorwaarts gemaakt en het is tegenwoordig een praktische, betrouwbare en betrekkelijk snelle manier geworden om achter de macromoleculaire architectuur van eiwitten te komen. Dit dankzij verbeterde X-stralen bronnen, betere focus tot kleinere oppervlakken van deze bronnen, verbeterde computers met hogere rekensnelheden, verbeterde grafische programma’s en gebruiksvriendelijkere software. Toch verloopt alles niet van een leien dakje. De bottleneck van deze structuurbepaling is nog steeds het kristalliseren van de macromoleculen. Kristallen niet alleen groeien, maar ze moeten groot genoeg worden, een eenkristal, een kristal bestaande uit 1 kristalrooster, vormen en X-stralen diffracteren met een voldoende hoge resolutie. Eiwitten zijn macromoleculen met variërende fysische en chemische eigenschappen afhankelijk van bepaalde omgevingsparameters zoals onder andere de pH, zoutconcentratie (ionensterkte), contaminanten, de verschillende conformaties in bijzijn van bepaalde liganden, etc. Dit maakt, gecombineerd met de beperkte kennis wat kristallisatie van macromoleculen betreft dat kristallisatie nog steeds de meest tijdsverslindende stap is in deze sierlijke methode om de architectuur van macromoleculen te bepalen.

Om er alsnog in te slagen om macromoleculen te kristalliseren is men dus verplicht om terug te vallen op strikt empirische methoden en op een zo exhaustief mogelijke manier zo veel mogelijk verschillende parameter ranges te testen, zodat men uiteindelijk een set van deze parameters bekomt waarin men kristallen bekomt die goed genoeg zijn voor X-stralen diffractie. Intelligente planningen kunnen maken, doorzettingsvermogen, geduld en ervaring in het vakgebied zijn voor een kristallograaf zeker geen overbodige eigenschappen.

Theorie van kristalgroei

Kristallen groeien uit gesupersatureerde oplossingen. In een gesatureerde oplossing zijn de vaste en opgeloste fase in evenwicht. Er kan geen groei optreden van de vaste fase, zoals neerslag of kristallen, want een netto overgang van de opgeloste naar de vaste fase gaat gepaard met een even grote netto dissolutie. Om kristallen te groeien moet de eiwitoplossing dus op de een of andere manier in een onevenwicht gebracht worden zodat de oplossing in de gesupersatureerde toestand komt en het voor de oplossing dus thermodynamisch gunstiger is om eiwitten naar de vaste-fase, het kristal, te drijven. De technieken hieronder besproken verschillen in de manier om de eiwitoplossing in de gesupersatureerde staat te krijgen.

Niet alle gesupersatureerde oplossingen zullen automatisch een vaste fase creëren, omdat, analoog aan de activatie-energie van een chemische reactie, er energie nodig is om deze vaste fase te creëren, zijnde precipitaat of de stabiele nucleus van een kristal.

Als een stabiele nucleus ontstaan is in de gesupersatureerde regio, dan zal het blijven groeien tot het evenwicht weer bereikt is. Een stabiele nucleus is: “een moleculair aggregaat van voldoende fysische coherentie en grootte zodat het andere moleculen zal aansporen om zich aan zijn groeiende oppervlakte te hechten, sneller dan dat ze weer kunnen oplossen." Zoals hierboven vermeld ontstaan nuclei alleen in de labiele fase. Hoe dichter het bij de metastabiele fase zal ontstaan, hoe trager het zal matureren. Hoe verder van de metastabiele regio het ontstaat, hoe sneller het zal matureren, maar de kans op ongecontroleerde nucleatie wordt ook groter, wat meestal in een reusachtige hoeveelheid kleine kristallen leidt, waarvan er geen enkele X-stralen kan of zal diffracteren. Door hun snelle groei zullen deze kristallen ook veel meer fouten in hun kristalrooster opbouwen, wat nog meer tot een slechtere diffractie leidt. Met andere woorden, kristallen die ver in de labiele zone ontstaan (uit extreem gesupersatureerde oplossingen) zullen talrijk en klein zijn en veel groeidefecten vertonen. Ideale kristalgroei zal dus plaatsgrijpen als de nuclei gevormd worden net boven de metastabiele regio. Hier zullen weinig nuclei ontstaan en ze zullen traag groeien, maar ze zullen groter worden en minder defecten bevatten. Tegelijkertijd zullen ze vrij snel terugkeren in de metastabiele toestand, waardoor alleen de gevormde nuclei nog zullen groeien en er geen meer zullen bijkomen.

Reacties die naar het evenwicht vloeien zullen altijd trachten de entropie te verhogen, maar de moleculen zullen zichzelf bij kristallisatie in een vrijheidsbeperkend rooster dwingen en chemische bindingen en interacties aan te gaan. Dit doen ze om de vrije energie (de Gibbs vrije energie) van het systeem tot een minimum te beperken. Deze bindingen zijn niet-covalente chemische - en fysische bindingen die niet voorkomen in de opgeloste fase of sterker zijn dan diegene die er wel voorkomen. Deze bindingen houden de kristallen samen. Waarom zouden eiwitten perfect geordende kristalroosters vormen terwijl ze evengoed kunnen neerslaan in een ongecontroleerde en niet-geordende vorm onder de vorm van precipitaat? Omdat ze de grootst mogelijke hoeveelheid stabiele interacties en bindingen willen aangaan en de vrije energie op deze manier tot een minimum weten te beperken.

Methoden voor kristalgroei

Er worden in het algemeen 4 methoden gebruikt om eiwitten te kristalliseren. Deze zijn: vapor diffusion (verdamping), free interface diffusion (vloeistof – vloeistof diffusie), batch (mengen) en dialysis (membraan diffusie). De meest gebruikte techniek is vapor diffusion, en wel op 2 manieren. De 2 manieren om tot vapor diffusion te komen zijn “Hanging drop” en “Sitting drop”.

Vapor diffusion maakt gebruik van evaporatie en diffusie van water tussen 2 oplossingen met een verschillende concentratie om tot supersaturatie te komen.

De hulpmiddelen voor de hanging drop techniek zijn: kristalboxen (24 well platen), niet gesiliconiseerde dekglaasjes (18 mm doorsnede) en vet om de wells luchtdicht af te sluiten. De wells worden gevuld met de zogenaamde “mother liquor” (ML). Een druppel van 1 µl ML wordt gespot op het dekglaasje en er wordt een druppel van 1 µl bijgevoegd, zodat men uiteindelijk een 1:1 druppel krijgt waarin de concentratie aan precipitans de helft is van die in het reservoir. Het dekglaasje wordt dan ondersteboven in de well gehangen. Door het concentratieverschil zal water uit de druppel diffunderen en zal de druppel de gesupersatureerde staat bereiken. Dankzij het vet is het reservoir luchtdicht afgesloten en kan de druppel niet uitdrogen. Aangezien het volume van het reservoir veel groter is dan die van de druppel is de hoeveelheid water die het reservoir verlaat door diffusie te verwaarlozen.
Een alternatieve manier voor hanging drop is de sitting drop techniek. Het reservoir wordt weer gevuld met ML, een druppel van 1 µl eiwit wordt gespot op het tafeltje en een druppel van 1 µl ML wordt er aan toegevoegd. Deze boxen worden afgesloten met een heldere, doorschijnende tape.

Vapor diffusion is een optimale techniek om grote hoeveelheden condities te screenen en ook om kristallen op te groeien, omdat maar kleine hoeveelheden eiwit nodig zijn om kristallen te vormen, wat bij een eiwit als KP dat slechts weinig overgeëxpresseerd wordt, zeker geen overbodige luxe is. Een klein nadeel is wel dat de kristallen verkregen via vapor diffusion meestal kleiner zijn als bij de andere methoden.

Alternatieve methoden voor kristalgroei

Free interface diffusion

Dit wordt vooral gebruikt om grotere kristallen te groeien. Een laagje lage densiteit oplossing wordt op een laagje hoge densiteit oplossing gebracht, meestal in de vorm van een geconcentreerde eiwitoplossing op een geconcentreerde zoutoplossing. Nucleatie en kristalgroei hebben plaats op de grens tussen de 2 lagen. De 2 oplossingen zullen over de tijd langzaam mengen, zodat er uiteindelijk een evenwicht ontstaat. Deze oplossingen zijn zo gemaakt dat er na instelling van het evenwicht de concentratie van het precipitans nog steeds hoog genoeg is om tot kristalgroei te leiden. Deze methode verbruikt vrij grote hoeveelheden eiwit omdat de eiwitoplossing geconcentreerd moet zijn.

Batch

In de batch methode wordt geconcentreerd eiwit gewoon gemixt met geconcentreerd precipitans zodat de finale oplossing zich in de gesupersatureerde staat bevindt in termen van eiwit en aldus kristalgroei kan promoten. Dit kan met milliliters tegelijkertijd gebeuren zodat de kristallen vrij groot kunnen worden omdat er meer opgelost eiwit aanwezig is. Overbodig te vermelden dat deze werkwijze zeer eiwitverslindend is en dus niet wordt gebruikt om condities te screenen.

Dialysis

Deze methode equilibreert 2 oplossingen door ze door een semi-permeabel membraan te laten diffunderen, zodat ze langzaam de concentraties bereiken die vereist zijn om tot kristalvorming te leiden. De eiwitoplossing bevindt zich in het membraan en zal zich langzaam equilibreren met de precipitans oplossing buiten het membraan. Door deze diffusie doorheen het membraan wordt langzaam supersaturatie bereikt, wat uiteindelijk tot kristallisatie kan leiden. Dialyse kan op 2 manieren gebruikt worden. De ene methode gebruikt simpelweg een membraanzak, die in de oplossing gehangen kan worden. De andere methode is ingenieus en eleganter en behelst “dialyse buttons” verkrijgbaar in verschillende maten

Het voordeel van dialyse tegenover de andere methoden is dat het eiwit gerecycleerd kan worden door simpelweg de eiwitoplossing in het membraan van de ene precipitans oplossing in de andere kan brengen. Zodoende kan de juiste conditie gevonden worden voor kristallisatie. Een nadeel is dat deze conditie niet werkt bij polyethyleenglycol (PEG), aangezien deze grote polymeren niet door het membraan kunnen diffunderen en omdat ze de neiging hebben om al het water uit de dialyse zak te trekken wat tot precipiterend proteïne leidt.

Gevorderde methoden voor kristalgroei

Naast de 4 hiervoor vermelde methoden om tot kristalvorming te komen (zie methoden), zijn er nog andere methoden om tot kristallen te komen, hoewel deze vertrekken van kristallen zelve en niet van een eiwitoplossing. Deze gevorderde methoden slaan de nucleatiestap over door nuclei van eerder gevormde kristallen te introduceren in een medium waarin nuclei stabiel zijn en waarin kristalgroei mogelijk is (de metastabiele regio). Deze methoden worden “seeding” genoemd, omdat men nuclei brengt, “zaait”, in een metastabiele eiwitoplossing. Deze methode wordt opgesplitst in 2 categorieën: macroseeding, waar grotere kristallen als zaailingen gebruikt worden en microseeding, waarbij microkristallen (nuclei) gebruikt worden. Seeding kan een manier zijn om mooier gevormde en beter diffracterende kristallen te verkrijgen, maar dit is geen zekerheid, aangezien ook slechtere kristallen kunnen bekomen worden.

Microseeding

Een aantal kristallen zullen vergruisd worden met behulp van de “seed beadTM kit” van Hampton research. Door vortexen zal een klein balletje in het epje de kristallen kapot slaan en vergruizen tot microkristallen. Van deze bekomen oplossing zal een verdunningsreeks gemaakt worden. Als de nuclei oplossing te geconcentreerd is zullen er vele kleine kristalletjes ontstaan. De microkristallen worden gezaaid in geëquilibreerde hanging drop druppels. Bij verdunningen zullen er in de lager geconcentreerde oplossingen maar een paar kristallen ontstaan, maar deze zullen wel groter worden, terwijl te laag geconcentreerde oplossingen geen kristallen zullen doen ontstaan.

Macroseeding

Deze techniek wordt vooral gebruikt om kristallen groter te maken. Hele kristallen worden uit hun druppel opgepikt en gewassen. De kristallen worden gewassen om enige achtergebleven nuclei op de randen van de eiwitten te verwijderen. De randen van de eiwitten zullen ook en beetje smelten (terug oplossen). Als deze kristallen weer in een metastabiele eiwitoplossing gebracht worden zullen ze aangroeien. Deze omgeving is een geëquilibreerde hanging drop druppel in dit experiment. Net zoals bij micoseeding is deze techniek niet altijd succesvol. De gebruikte macroseeding manier was ”Streak seeding”. Met een paardenhaar worden kristallen opgepikt uit hun omgeving en dan gewassen. Deze worden in 1 beweging door een nieuwe, geëquilibreerde druppel gehaald, en daarna door nog een druppel. In deze 2e druppel zullen minder kristallen gezaaid worden dan in de vorige.

Te screenen parameters

Zoals vermeld zijn er vele condities die getest moeten worden en zijn er andere parameters die de vorm, grootte, eigenschappen en diffracterend vermogen van de eiwitten beïnvloeden. In deze paragraaf worden ze op een rijtje gezet.

Zuiverheid

De zuiverheid van de eiwitoplossing is een van de meest belangrijke factoren. Kristalgroei heeft de natuurlijke neiging om onzuiverheden te weren, maar hoge concentraties aan onzuiverheden zullen alsnog leiden tot imperfecties in het kristalrooster.

Gebruikte methode

De methode die gebruikt wordt kan een invloed hebben op de kristallen. Zelfs sitting drop en hanging drop kunnen verschillende kristallen voortbrengen bij dezelfde condities. Ook de ervaring en bedrevenheid van de onderzoeker kan een rol spelen bij de subtiele handelingen die kristallisatie vereisen.

Precipitansen en hun concentratie

Chemische precipitansen zijn de meest gebruikte methode om supersaturatie te bereiken in een eiwitoplossing om kristalgroei te induceren. Deze stoffen en hun concentratie hebben eerder een invloed op het water van de oplossing en niet op het eiwit zelf. De meest gebruikte zijn zouten, polymeren en ook wel organische solventen. Andere (minder gebruikte) precipitansen zijn MPD (een klein polyalcohol), sulfonic dyes en gedeïoniseerd water. Al deze precipitansen maken deel uit van de Hampton research additives screening kit HR2-428.

Zouten

Deze zijn bij uitstek de meest gebruikte precipitansen in eiwitkristallografie. Een nadeel is dat ze de gemiddelde electronendensiteit van de oplossing doen stijgen, zodat de “signal to noise ratio” van kristallografische data zal dalen. De doeltreffendheid van een zout als precipitans is proportioneel met zijn de vierkantswortel van de valenties van de kationen en anionen waaruit het is opgebouwd.

Dit wordt beschreven in de Hofmeier reeksen:

• PO43- > HPO42- = SO42- > citraat > CH3CO2 > Cl- > Br- > NO3- > ClO4- > SCN-
• NH4+ > K+ > Na+ > Li+

De zwakkere ionen in de Hofmeister reeksen hebben meer de neiging om eiwitten in te zouten dan om ze uit te zouten. Een typisch gebruikt zout in veel kristallisatie trials is AS, ammoniumsulfaat. Dit splitst in waterige oplossingen in SO42- en NH4+. Een aantal zouten maken deel uit van de Hampton research additives screening kit HR2-428.

Polymeren

Polyethyleenglycol is het meest gebruikte polymeer in kristal experimenten. Ze zijn commercieel beschikbaar in verschillende moleculaire gewichten, variërend van 200 (3 monomeren) tot meer dan 1 miljoen (15000 monomeren). Net zoals zouten zullen polymeren in competitie gaan met eiwit voor water. Een aantal polymeren maken deel uit van de Hampton research additives screening kit HR2-428. (Voor HR2-428 specificaties, zie addenda)

Organische solventen

Deze solventen, zoals acetone, ethanol en butanolen hebben de neiging om eiwitten te precipiteren maar ze worden vaker gebruikt bij de kristallisatie van nucleïnezuren. Kristallisatie door blootstelling aan organische solventen werd af en toe waargenomen tijdens de zuivering. Door hun hydrofobische natuur veroorzaken ze fase transities en verlagen ze de diëlectrische constante, een relatieve maat voor polariteit van een oplossing, van het solvent. Een aantal organische solventen maken deel uit van de Hampton research additives screening kit HR2-428.

Metaalionen

Toevoeging van metaalionen, en meer specifiek Cd2+, CO2+ en Mn2+ aan kristallisatie oplossingen verbeterde kristallisatie tot gevolg hebben. Deze divalente metaalionen doen dienst als een soort lijm om ofwel nucleatie te initiëren, oftewel kristallisatie te verbeteren. Ze doen dienst als liganden en kunnen verbeterde kristalroostercontacten tot gevolg hebben. Een aantal metaalionen maken deel uit van de Hampton research additives screening kit HR2-428.

Zuurtegraad

Ook een van de meest belangrijke parameters tijdens de kristallisatie is de pH. Sommige eiwitten kristalliseren over een heel brede pH range. Dit is echter voor een zeer beperkt aantal eiwitten. Het is veel typischer voor een eiwit om in een zeer smalle pH range te kristalliseren (<1 pH eenheid). Kristalvorm, het eenkristal-zijn en het uit meerdere nuclei bestaan van een kristal is meestal direct gerelateerd met de zuurtegraad. Dit, omdat de zuurtegraad van de omgeving van het eiwit een directe invloed heeft op lading van het eiwit en de daarmee verband houdende fysische en chemische eigenschappen die afhankelijk zijn van de ionisatie status van de aminozuren of chemische groepen van de macromolecule. De nettolading van het eiwit verandert volgens pH, net zoals de ladingsverdeling, het dipoolmoment, de conformatie en in veel gevallen ook de aggregatiestatus van het eiwit. Een pH screen is dus waarschijnlijk de belangrijkste analyse die moet uitgevoerd worden in een kristallisatie trial.

Temperatuur

De temperatuur is een andere belangrijke factor. Kristallisatie is succesvol gebleken in experimenten tussen de 60° C en minder dan 0° C, maar kristallisatie trials worden meestal uitgevoerd op 4° C en 20° C. Temperatuur heeft een invloed op de kinetiek van de kristallisatie reactie. Temperatuur heeft ook een invloed op de oplosbaarheid van het precipitans en de eiwitconcentratie en zodus op de kristallisatie van het eiwit.

Eiwitconcentratie

Ook de concentratie van het opgeloste eiwit speelt een rol. Meer eiwit kan voor grotere kristallen zorgen, maar kan er ook voor zorgen dat er ongecontroleerde nucleatie plaatsvindt in de druppel wat tot meer, kleinere en meestal inperfecte kristallen leidt. Een screen van de eiwitconcentratie kan dus in sommige gevallen een oplossing bieden. De eiwitconcentratie werd bepaald volgens de Bradford methode. De concentratie wordt benaderd aan de hand van een standaard ijklijn, zodat men vervolgens via de wet van Lambert – Beer de concentratie kan benaderen.

Modificeren van het eiwit

Een laatste mogelijkheid is het biochemisch of chemisch veranderen van het eiwit. Vervangen (muteren) of modificeren (derivatiseren) van bijvoorbeeld geladen groepen op de buitenkant van een eiwit kan leiden tot kristallisatie omdat de interactie tussen de macromoleculen onderling zal gewijzigd zijn.

Een eiwitkristal

Deze foto is getrokken van een eiwit dat Old Yellow Enzyme noemt. Dit is een eiwit dat goed kristalliseert en waarvan de 3D structuur al bepaald is, maar waarvan spijtig genoeg de functie nog steeds niet bepaald is.
Het kristal is gegroeid via vapour diffusion - hanging drop.