Hydrofobe interactie of reversed phase chromatografie

Hydrofobe interactie chromatografie of reversed phase chromatografie is een techniek om verschillende componenten in een oplossing te scheiden. De theorie erachter is dat verschillende substanties verschillende hydrofobe eigenschappen hebben. Hiervoor wordt een kolom gebruikt, gevuld met een hydrofobe substantie. Stoffen die hydrofober zijn zullen langer aan de kolom blijven haperen en er dus langer over doen om van de kolom te elueren. In dit artikel gaan we uit van een eiwitmengsel.

Inhoud

• De Butylkolom
• De akta explorer
• De gebruikte buffers
• De eiwitzuivering, het verloop
• De theorie van de zuivering
• Controle van de zuivering

De hydrofobe interactie, ook wel chromatografie kan gebruikt worden om vele verschillende substanties van elkaar te scheiden. Deze techniek wordt echter het meeste gebruikt om eiwitten in mengsels van mekaar te scheiden. Als men bijvoorbeeld 1 type eiwit uit een cel wilt halen en bestuderen, kan men het er niet gewoon uithalen. Dit vereist opeenvolgende zuiveringsstappen, tot men enkel en alleen het gewenste eiwit overhoudt.

De Butylkolom

Het te scheiden eiwitmengsel wordt over een butylkolom gebracht (zelfgepackte kolom). Butyl wordt zeer vaak gebruikt als scheidend materiaal, maar ook phenyl en octyl kolommen worden gebruikt. De butylkolom zal de eiwitten scheiden volgens hydrofobiciteit. Eiwitten die hydrofobe interacties aangaan met de kolom zullen langer op de kolom blijven dan andere meer hydrofiele eiwitten. Dit principe van scheiden wordt ook wel “Reversed Phase”chromatografie genoemd. Dit omdat de stationaire fase in den beginne van de chromatografie hydrofiel was wegens het polaire karakter van het gebruikte Silica (Si-OH), zodat hydrofobe bestanddelen eerst elueerden, wat aldus als “normaal” werd aanzien. De introductie van alkylgroepen (zoals Butyl (C4)) maakte de stationaire fase hydrofoob, zodat hydrofiele bestanddelen nu eerst elueerden, aldus “omgekeerd”.

De akta explorer

De butylkolom wordt aangesloten op een Ảkta Explorer. Deze machine zal de kolom onder hoge druk brengen zodat de zuivering beter, sneller en met een hogere resolutie zal verlopen. Hij wordt gefabriceerd door GE Healthcare science
Deze fabrikant heeft ook nog andere systemen, die een onderzoeker helpen bij zijn eiwitzuiveringen.

De gebruikte buffers

De buffers

Er worden 2 buffers gebruikt in deze eiwitseparatie.

• Buffer A bestaat uit Tris (de triviale naam ‘trishydroxymethylaminomethane’ voor 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol) buffer (pH 8), Ammoniumsulfaat (AS) en PMSF (phenylmethanesulphonylfluoride).
• Buffer B heeft dezelfde bestanddelen, op AS na. De reden hiervoor wordt verderop uitgelegd.

Beide buffers werden eerst over een micropore filtertje gefilterd, om stof en andere kleine partikels die eventueel de kolom zouden kunnen verstoppen te verwijderen.

De bestanddelen

• Tris doet dienst als pH-buffer. Het heeft een pKa van 8.1 en een effectieve bufferrange van pH 7.2 tot pH 9. Buffer A werd met behulp van NaOH en HCl op een pH van 8 gebracht.
• PMSF is een serine protease inhibitor, werkzaam bij concentraties tussen de 0.1 en 1 mM. Het wordt toegevoegd aan de buffer om eventuele serine proteasen die ook in het mengsel zitten te inhiberen, zodat ze het te onderzoeken eiwit niet kunnen degraderen. Dit, aangezien de eiwitten bekomen werden door de cellen in kwestie te lyseren. Serine proteasen zijn endopeptidasen met een karakteristiek serine residu in de active site. De half-life van PMSF in water is maar 35 minuten bij pH 8, maar dit is ruim voldoende om het eventueel aanwezige protease te inhiberen tijdens de periode dat het eiwitmengsel niet op ijs staat, met andere woorden tijdens de zuivering.
• AS is een zout en wordt gebruikt om zogenaamde uitzouting te bekomen. Het AS gaat met de eiwitten in competitie voor watermoleculen, zodat bij oplopende concentraties het eiwit meer en meer in oplossing zal vervangen worden door AS. Het eiwit zal dus bij wijze van spreken uit het water gejaagd worden door AS.

De eiwitzuivering, het verloop

De kolom wordt, na het wassen van de Ảkta Explorer en de kolom, geëquilibreerd met buffer A. Dit wil zeggen dat de Ảkta Explorer 100% buffer A over de kolom brengt. Daarna wordt het staal (het eiwitmengsel na de hittebehandeling) op de kolom geladen. Door de hoge concentratie AS op de kolom, zullen de eiwitten uit oplossing gedreven worden en zich met hydrofobe interacties aan de butyl kolom vasthechten.

Als al het staal op de kolom werd gebracht wordt er eerst een aantal kolomvolumes buffer A over de kolom gebracht, zodat niet intragerende eiwitten van de kolom gespoeld worden. Daarna wordt er een gradiënt aangelegd van 100% buffer A naar 100% buffer B op een tijdslimiet van ongeveer een 30-40 tal minuten. Dit principe noemt men gradiënt elutie. De zoutconcentratie zal hierdoor continu veranderen, stijgen in dit geval, wat over het algemeen een betere scheiding van eiwitten oplevert dan wanneer men de tweede buffer stapsgewijs zou toevoegen.

De theorie van de zuivering

De concentratie van de oplossing die uit het systeem vloeit is te allen tijde gegeven als:

[C]=[C2]-([C2]-[C1])f

Waarbij [C] de concentratie is van de oplossing die uit het systeem loopt, [C1] de initiële concentratie is van buffer A, [C2] de initiële concentratie is van buffer B en f de restfractie is van de som van de oorspronkelijke volumes van de beide buffers.

Hoe langer de retentietijd, hoe hoger de resolutie theoretisch zal zijn, maar een tijd van 30 minuten is werkbaar en levert een voldoende goede scheiding. De gradiënt zal ervoor zorgen dat de concentratie AS langzaam afneemt, zodat de meest hydrofiele eiwitten langzaam van de kolom zullen elueren. Naarmate de concentratie B toeneemt, zullen ook de meer hydrofobe eiwitten in oplossing gaan omdat ze niet meer in competitie moeten met de zoutionen. Door fractionering wordt het eiwit opgevangen in epjes. In elk epje wordt 1 ml eluens opgevangen.

De scheiding wordt gevolgd via UV absorbantie. Peptidenbindingen absorberen UV straling van met een golflengte van 220 nm. De hoogste piek op het chromatogram is van het te onderzoeken overgeëxpresseerde eiwit, aangezien een hogere piek correspondeert met meer eiwit en we verwachten dat het overgeëxpresseerde eiwit dan ook in hoge concentraties aanwezig is. De fracties corresponderend met deze piek bevatten dan ook het te onderzoeken eiwit.

Controle van de zuivering

De fracties aan de rand van de piek zullen op een SDS-PAGE gel geladen worden, teneinde de fracties die te weinig gewenst eiwit en te veel contaminanten bevatten niet meer mee te nemen in eventuele volgende zuiveringsstappen, en de fracties die genoeg eiwit bevatten (en minder contaminanten) te weerhouden. Na deze beslissing worden de fracties weer gepoold voor de volgende zuiveringsstap.