Southern Blotting: Methode en toepassingen

Southern blotting is een methode om een specifieke DNA sequenties op te sporen in een DNA sample. Deze methode is vernoemd naar de ontdekker, namelijk de Britse bioloog Edwin Southern. Deze techniek is gebaseerd op de hybridisatie van gelabelde complementaire DNA sequenties. In dit artikel wordt besproken hoe southern blotting precies wordt uitgevoerd en welke toepassingen deze onderzoeksmethode heeft.

Methode

Men heeft dus een DNA sample waarvan men wil testen of het bepaalde DNA sequenties bevat. Hierbeneden wordt stap voor stap uitgelegd hoe men dit test door middel van southern blotting.

1. Samples van DNA worden geknipt met verschillende restrictie-endonucleases. Hierdoor worden DNA-fragmenten gevormd van verschillende lengte, afhankelijk van de restrictielocaties.
2. De DNA-fragmenten worden gescheiden op basis van grootte door middel van agarose gel electroforese. Kleinere fragmenten bewegen zich hierbij sneller naar de positieve elektrode dan de grotere en worden dus op die manier gesorteerd op grootte. Een sample van DNA size markers, dit is een oplossing van DNA-fragment waarvan de grootte bekend is, wordt ook gesepareerd op een andere strook.
3. Hierna wordt het DNA gekleurd met ethidium bromide, zodat het gezien kan worden onder UV-licht.
4. De gel wordt doordrenkt met een alkaline oplossing om het dubbelstrengs DNA te denatureren tot enkelstrengs DNA. De gel wordt geneutraliseerd en aangebracht op een vloeipapier (van nitrocellulose) op een glazen plaat.
5. Het eind van dit vloeipapier staat in een bak met bufferoplossing. Een stukje van membraanfilter wordt er op gelegd zodat het de gel bedekt. Velletjes vloeipapier of papieren doeken en een gewicht worden opgestapeld bovenop het membraanfilter. De bufferoplossing in bak wordt opgezogen door het vloeipapier. De oplossing gaat hierbij door de gel en het membraanfilter en als laatste door de stapel van vloeipapiertjes. Gedurende dit proces worden DNA-fragmenten opgepikt door de buffer en overgebracht van de gel naar de membraanfilter. Aan dit membraanfilter binden de DNA-fragmenten zich door de chemische eigenschappen die deze membraanfilter heeft. De DNA-fragmenten zijn precies op dezelfde manier gerangschikt als hoe ze waren in de gel.
6. Een gelabelde probe, dit is een stukje enkelstrengs DNA dat complementair is aan een stuk DNA dat zich eventueel bevindt in het onderzochte DNA, wordt toegevoegd aan het membraanfilter. Deze gelabelde probe hybridiseert met elk complementair DNA-fragment tot dubbelstrengs DNA.
7. Detectie van de probe wordt uitgevoerd op basis van het wel of niet aanwezig zijn van radioactiviteit. Dit wordt zichtbaar gemaakt met röntgenstraling. De grootte van de gehybriseerde DNA-fragmenten kan worden berekend met behulp van het vergelijken met de DNA size markers waarvan de grootte bekend is. Van de fragmentgroottes die hierbij verkregen worden, kan een restricitiekaart worden gemaakt die de relatieve posities van de restrictielocaties toont.

Toepassingen

Southern blotting heeft meerdere toepassing. Een van de belangrijkste toepassing van southern blotting is DNA fingerprinting. Dit wordt onder andere gebruikt bij forensisch onderzoek. Door het vergelijken van het DNA van een verdachte en van een spoor dat gevonden is, bijvoorbeeld bloed of haar, kan dit belangrijke informatie zijn bij het vinden van de dader.
Verder kan het gebruikt worden om bacteriekolonies te detecteren door autoradiografie. Hierbij worden DNA fragmenten toegevoegd aan de plasmiden en worden de kolonies gekopieerd. Het DNA wordt vervolgens gedenatureerd en gelabeld DNA wordt hier aan toegevoegd. Dit gelabeld DNA wordt zichtbaar gemaakt door autoradiografie en op die manier kan dus een bacteriekolonie gedetecteerd worden.